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Gentechnische Herstellung von Peptidhormonen |
Titel: Gentechnische Herstellung von Peptidhormonen
Kategorie: Biologie / Genetik und Gentechnologie
Gentechnische Herstellung eines Peptidhormons am Beispiel von Somatostatin
Bei Somatostatin handelt es sich um ein Hormon, das therapeutisch eingesetzt wird.
Um den Stoff nicht aufwendig aus Schafshirnen gewinnen zu müssen (wie noch bis in die 70er Jahre üblich), stellt man die Substanz heute gentechnisch her.
Somatostatin besteht aus einer Sequenz von 14 Aminosäuren, welche bekannt ist. Anhand einer Code-Sonne kann daraus die Nukleotidsequenz, die das Hormon codiert, abgeleitet werden. Diese wird zusammen mit der Basensequenz für Methionin (eine Aminosäure) an das erste Strukturgen des lac-Operons (lac -> Lactose) angehängt. Ein Stoppsignal wird nicht dazwischen eingefügt. Dieses konstruierte lac-Operon wird zusammen mit dem Regulatorgen des lac-Operons in ein Plasmid aus E. Coli integriert.
Das verwendete Plasmid wird zum Vektor, zur Fähre für die neue genetische Information.
Ein zu benutzendes Plasmid muss über zwei Antibiotika-Resistenzgene verfügen. Dies ist im weiteren Verlauf von Bedeutung, wenn die Bakterienkultur selektiert werden soll, die das Hormon herstellen kann.
Um das veränderte lac-Operon in das Plasmid einsetzen zu können, wird es mit einer Restriktionsendonuclease (=Enzym) aufgetrennt. Es gibt verschiedene Restriktionsendonucleasen, die eine DNA-Sequenz jeweils an spezifischen, charakteristischen Sequenzstellen schneiden. Dabei entstehen statt eines geraden Schnitts durch den DNA-Strang zwei Stränge mit "sticky ends", also "klebrigen" Enden. Die beiden komplementären Stränge der DNA sind an den Enden also nicht gleich lang, sodass jeweils ein Strang übersteht:
Der Name "sticky ends" rührt daher, dass sich die so geschnittenen Enden elektrostatisch anziehen (daher "klebrig" / "sticky").
Nun muss dafür gesorgt werden, dass die einzusetzende DNA-Sequenz, also das veränderte lac-Operon, die gleichen, dazu passenden "Schnittkanten" besitzt, damit es in das aufgetrennte Plasmid passt. Dies wird durch Verwendung der gleichen Restriktionsendonuclease erreicht (gleiches Enzym => gleiche sticky ends).
Damit das Enzym sie schneiden kann, muss die einzusetzende DNA-Sequenz von den Erkennungsstellen der Endonuclease "umrahmt" sein.
Derartig behandelte Plasmide und Spender-DNA-Sequenzen werden zusammengegeben. Ligase-Enzyme verbinden die Stränge mit den sticky ends, sodass ein rekombinantes Plasmid mit dem neuen Teilstück entsteht. (Obwohl hier in der Einzahl ("ein ... Plasmid") geschrieben wird, passiert dies natürlich vielfach.)
Die Zielbakterienkultur (E. Coli) nimmt die hergestellten Plasmide auf (Transformation). Es entstehen rekombinante Bakterien.
Als Nächstes müssen die Bakterien selektiert werden, die ein Plasmid mit der neuen Sequenz aufgenommen haben. Hier macht man sich die Resistenzgene zu Nutze:
Ein Resistenzgen, das z. B. eine Resistenz gegen Ampicillin codiert, belässt man in seiner Funktion bestehen. Bakterien, die ein erzeugtes Plasmid erhalten haben, sind gegen dieses Antibiotikum somit resistent. Die Kultur wird daher auf einen Nährboden übertragen, der dieses Antibiotikum (im Beispiel Ampicillin) enthält. Bakterien, die überleben, haben das Plasmid erhalten.
Das zweite Resistenzgen (z. B. Resistenz gegen Tetracyclin) wird durch das Einsetzen der Spender-DNA in das Plasmid funktionsunfähig gemacht. Von den verbliebenen Bakterienstämmen müssen nun also die selektiert werden, denen diese Resistenz fehlt. Genau diese haben nämlich das erfolgreich zusammengesetzte Plasmid (inkl. der neuen Sequenz) aufgenommen. Dazu wird ein Nährboden mit Tetracyclin verwendet.
Bakterien aus Stämmen, die auf Ampicillin-Nährboden leben können, aber auf Tetracyclin-Nährboden absterben, sind die gewünschten rekombinanten Bakterien. Sie können Somatostatin herstellen.
Da der Code für das Protein im lac-Operon, also in einem von dessen Strukturgenen, enthalten ist, kann die Hormonproduktion – abhängig vom lac-Operon – gesteuert werden, indem Lactose hinzugefügt wird oder nicht.
(Die entstehenden Polypeptide bestehen jedoch nicht nur aus dem gewünschten Hormon, sondern noch weiteren Aminosäuren. Sie werden durch ein weiteres Enzym, Bromcyan, abgeschnitten, wodurch Somatostatin entsteht.)
Wie bereits erwähnt wurde, erfolgt die Somatostatin-Produktion substratinduziert (über das lac-Operon):
Substrat (Lactose) vorhanden
⇓
Allosterische Veränderung des Repressors
→ Inaktivierung
⇓
Produktion von Somatostatin
(Expression des veränderten Strukturgens)
| | Substrat (Lactose) nicht vorhanden
⇓
Repressors wird nicht verändert
→ bleibt aktiv
⇓
keine Produktion von Somatostatin
(keine Expression des veränderten Strukturgens)
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| Aus dem Lexikon |
Ostrakismos
Ostrakismos ("Scherbengericht") bezeichnet ein Verfahren, das in der griechischen Antike in Athen zum Einsatz kam, um Störenfriede aus der Gesellschaft auszusondern.
Die Volksversammlung [...] [Mehr lesen]
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